Các bước phát triển phương pháp HPLC trong kiểm nghiệm dược phẩm & thực phẩm

Các bước phát triển phương pháp HPLC trong kiểm nghiệm dược phẩm & thực phẩm

Phát triển và xác nhận các phương pháp mới để phân tích bằng HPLC (sắc ký lỏng hiệu năng cao) rất tốn kém và mất thời gian. Trước khi bắt đầu quá trình này, việc khảo sát và tìm kiếm tài liệu cho việc phân tích các hợp chất phân tích dự kiến hoặc các hợp chất tương tự là cực kỳ quan trọng.

Việc tìm kiếm này bao gồm đánh giá các nguồn có liên quan như các tài liệu, quy chuẩn, tiêu chuẩn (ví dụ Dược Điển Việt Nam, BP, USP, EP); các bài báo, tạp chí khoa học (ví dụ:  AOAC , Anal. Chem. v.v.), các tài liệu và ứng dụng từ nhà sản xuất; và  các nguồn khác trên Internet. Mặc dù các loại tìm kiếm này có thể không phát hiện ra một phương pháp có thể sử dụng trực tiếp, nhưng nó thường cung cấp một điểm khởi đầu tốt hoặc thông tin hữu ích khác.

Phát triển phương pháp mới là cần thiết, nếu:

• Các phương pháp hiện tại không có sẵn
• Các phương pháp hiện tại không chính xác, không đủ độ tin cậy, chính xác, không đáp ứng yêu cầu hoặc tuân thủ quy định
• Thiết bị hoặc kỹ thuật mới có hiệu suất cao hơn (ví dụ: UHPLC, HILIC, LC / MS).

5 Bước để phát triển một phương pháp phân tích bằng HPLC

Bước 1: Xác định loại phương pháp và mục tiêu của quá trình phân tách bằng sắc ký

• Định lượng
• Định tính
• Dành cho sắc ký điều chế

Bước 2: Thu thập thông tin mẫu và chất phân tích

• Nền mầu phân tích là gì
• Số hợp chất và khoảng nồng độ có trong mẫu
• Thông tin đầy đủ về chất phân tích như cấu trúc, khối lượng phân tử, độ tinh khiết, độ tan, các nhóm chức, hấp thu cực đại, độ bền, MSDS, v.v…
• Các thông tin khác về chất chuẩn thương mại, phương pháp phân tích hiện hành…

Bước 3: Điều kiện sắc ký cho lần chạy đầu tiên

• Đầu dò: PAD (nếu hợp chất có độ hấp thu ánh sáng), hoặc MS (với hợp chất không hấp thu, chế độ scan)
• Cột HPLC: C18 hoặc C8, cột mới hoặc mới sử dụng chưa lâu (< 6 tháng), kích thước có thể là:
  

  Lắp cột HPLC

  • 5μm, 4.6x250mm
  • (ví dụ: Extrasil C18/ chromaPure, InertSustain C18/ GL,…) với tốc dộ dòng 1 ml/phút dành cho các ứng dụng HPLC truyền thống
  • 2.7μm, 2.1x100mm
  • (ví dụ: Coresil C18/ chromaPure, …) với tốc độ dòng 0.3 ml/phút dành cho các ứng dụng LC/MS hoặc sắc ký nhanh UHPLC
• Pha động: ACN (hoặc MeOH) và H₂O (chứa 0.1% acid formic)
• Gradient: ACN:H₂O 5:95 đến ACN:H₂O 100:0 trong 15+5 phút (8+2 phút với UHPLC)

Bước 4: Tinh chỉnh và tối ưu hóa phương pháp (bước tốn nhiều thời gian nhất)

Tối ưu các thông số sao cho phù hợp với yêu cầu (ví dụ, Dược điển Việt Nam, USP…), các thông số bao gồm:

Sắc ký đồ Ginsenosides trên cột HPLC Coresil C18, 2.1×100 mm, 2.7µm

• Pha động: loại pha động, loại dung dịch đệm & nồng độ, pH, tỷ lệ dung môi
• Thông số HPLC/ UHPLC:
  • Tốc độ dòng
  • Nhiệt độ lò cột
  • Thông số gradient (nếu cần thiết)
  • Thông số cột: pha tỉnh (ví dụ C18, C8, CN, NH2, phenyl,…), kích thước hạt, đường kính, chiều dài, tỷ lệ carbon hóa,…
  • Thể tích tiêm mẫu
• Thông số đầu dò: bước sóng (PDA, UV-VIS), m/z (khổi phổ), v.v..
• Quy trình xử lý mẫu & pha loãng (nếu cần thiết)

Bước 5: Tiền thẩm định phương pháp

Ở bước tiền thẩm định này, cần thử nghiệm một số thí nghiệm về tính đặc hiệu, độ nhạy, độ tuyến tính.

Nếu phương pháp mới được phát triển vượt qua các yêu cầu chập nhận, không có vấn đề phát sinh thì có thể thực hiện chính thức việc thẩm định phương pháp với giao thức, văn bản và các tiêu chí theo quy định cần thiết (ví dụ: GMP, EU…)

CẦN ĐÀO TẠO VỀ NGHIỆP VỤ KIỂM NGHIỆM? Xêm thêm:

Dịch vụ đào tạo và huấn luyện nghiệp vụ tại phòng thí nghiệm